Геном | Хэфэй Компоненты Инк.

Nature Communications, том 13, номер статьи: 7962 (2022) Цитировать эту статью

3662 Доступа

1 Цитаты

19 Альтметрика

Подробности о метриках

d,d-транспептидазная активность пенициллинсвязывающих белков (PBP) является хорошо известной основной мишенью β-лактамных антибиотиков, которые блокируют полимеризацию пептидогликана. Уничтожение бактерий, вызванное β-лактамами, включает в себя сложные последующие реакции, причины и последствия которых трудно устранить. Здесь мы используем функциональную замену PBP на β-лактам-нечувствительную 1,d-транспептидазу для идентификации генов, необходимых для смягчения эффектов инактивации PBP β-лактамами в активно делящихся бактериях. Функции 179 условно незаменимых генов, идентифицированных с помощью этого подхода, выходят далеко за рамки 1,d-транспептидазы, партнеров по полимеризации пептидогликана, и включают белки, участвующие в реакции на стресс и в сборке полимеров внешней мембраны. Неожиданные эффекты β-лактамов включают потерю опосредованной липопротеинами ковалентной связи, которая связывает внешнюю мембрану с пептидогликаном, дестабилизацию клеточной оболочки, несмотря на эффективное сшивание пептидогликана, и повышенную проницаемость внешней мембраны. Последний эффект указывает на то, что механизм действия β-лактамов включает самопроизвольное проникновение через внешнюю мембрану.

Грамотрицательные бактерии, такие как Escherichia coli, обладают многослойной оболочкой, которая поддерживает тургорное давление цитоплазмы (пептидогликан клеточной стенки) и действует как селективный химический барьер для питательных веществ, отходов и токсичных соединений (внутренние и внешние мембраны) (рис. 1а)1. Несколько полимеров, содержащих белковые, пептидные, гликановые и липидные фрагменты, обеспечивают механические свойства и транспортные функции оболочки. Пептидогликан (ПГ), который ковалентно связан с внешней мембраной через липопротеин Брауна, представляет собой гигантскую сетчатую макромолекулу (около 109 Да), полимеризованную из дисахаридно-пентапептидного звена (рис. 1б). Гликозилтрансферазы катализируют образование β-1,4-гликозидных связей между дисахаридами с образованием гликановых цепей, которые впоследствии сшиваются друг с другом транспептидазами (рис. 1в). Последние ферменты, d,d-транспептидазы, также называются пенициллинсвязывающими белками (PBP), поскольку они являются основными мишенями β-лактамных антибиотиков. При полимеризации пептидогликана PBP взаимодействуют с концом d-Ala4-d-Ala5 пентапептидного стебля (отсюда и обозначение d,d) и образуют ковалентную связь между d-Ala4 и остатком Ser в их активном центре с одновременным высвобождением d. -Ала5. На следующем этапе полученный ацил-фермент реагирует со вторым субстратом, чаще всего тетрапептидным стеблем, с образованием 4 → 3 сшитого димера Тетра-Тетра с одновременным высвобождением PBP (рис. 1c; дополнительный рис. С1а)2. В сотрудничестве с каркасными белками и эндопептидазами d,d-транспептидазы опосредуют вставку гликановых нитей в расширяющуюся сетчатую макромолекулу PG, тем самым определяя форму бактерии и обеспечивая механический барьер против осмотического давления цитоплазмы в течение всей клетки. цикл3,4,5,6,7.

а Оболочка состоит из внутренней (IM, серая) и внешней (OM, черная) оболочек. Пептидогликан (ПГ, синий) обеспечивает осмотическую защиту бактериальной клетки. ИМ представляет собой липидный бислой, состоящий в основном из фосфолипидов (ФЛ). OM представляет собой асимметричный липидный бислой: внутренний листок состоит из PL, а внешний листок — из липополисахаридов (LPS) и фосфатидилглицеридов, замещенных общим энтеробактериальным антигеном (ECAPGL). б Структура субъединицы PG (GlcNAc, N-ацетилглюкозамин; MurNAc, N-ацетилмурамовая кислота). в PG представляет собой сетчатую макромолекулу, состоящую из гликановых цепей (сине-фиолетовые многоугольники), сшитых между собой короткими пептидными стеблями (цветные кружки). PBP катализируют образование 4 → 3 поперечных связей, соединяющих 4-е положение ацильного донорного стебля с 3-м положением акцептора. Два члена семейства LDT (YcbB и YnhG) катализируют образование поперечных связей 3 → 3. Три LDT (ErfK, YbiS и YcfS) закрепляют липопротеин Брауна (Lpp) на PG. Связывание DAP в 3-м положении донорского стебля PG с конечностью Arg-Lys Lpp обеспечивает ковалентную связь между OM и PG. Звено PG-Lpp гидролизуется ЯфК ЛДТ46,47. г профиль rpHPLC муропептидов из штамма BW25113(ycbB, relA'), выращенного без цефтриаксона. О структуре судят по фрагментам, полученным расщеплением ПГ мурамидазами, расщепляющими связь MurNAc-GlcNAc β-1,4. e Структура муропептидов установлена на основе масс-спектрометрического анализа. Исходные данные предоставляются в виде файла исходных данных.

90% of the resulting muropeptides recycled by the cell37,38. This involves the retrograde transport of PG fragments into the cytoplasm by specialized permeases, AmpG and the Opp complex, followed by the recycling of the sugar and peptide moieties as glucosamine and tripeptide l-Ala-γ-d-Glu-DAP, respectively (Fig. 4a). Tn-seq analysis showed that genes encoding the AmpG permease and each component of the Opp complex were fully dispensable for growth both in −CRO and +CRO conditions. We further demonstrated that PG recycling was fully dispensable by constructing a ΔampG ΔoppF ΔmppA triple mutant that was found to be viable and resistant to ceftriaxone in spite of the loss of both transporters (Supplementary Fig. S3a). Nevertheless, the cytoplasmic l,d-carboxypeptidase LdcA was essential in the +CRO but not in the −CRO condition (Supplementary Data File 1b; Supplementary Data File 2). This enzyme was previously shown to trim d-Ala4 from recycled tetrapeptide stems to provide the l-Ala-γ-d-Glu-DAP tripeptide that is directly added to UDP-MurNAc by the Mpl ligase39,40. Disruption of the gene encoding LdcA was reported to result in bacteriolysis during stationary growth, attributed to dramatically decreased cross-linking as recycled tetrapeptide stems cannot serve as acyl donors by d,d-transpeptidases (Supplementary Fig. S1)40. The same explanation cannot account for the essential role of LdcA in ceftriaxone resistance since YcbB uses tetrapeptide stems as acyl donors8. Nonetheless, the essential role of LdcA in the +CRO condition stemmed from elimination of imported tetrapeptides since deletion of the mpl gene restored growth of the ΔldcA mutant in the presence of ceftriaxone (Supplementary Fig. S3a). Overexpressing murA, encoding the enzyme catalyzing the first committed step of PG synthesis (Fig. 4a), also restored resistance of the ΔldcA mutant (Supplementary Fig. S3b). Thus, boosting the metabolic flux trough the PG assembly pathway compensates for the toxicity of the imported tetrapeptides. Together, these results indicate that Mpl ligates the tetrapeptide onto UDP-MurNAc and that in the absence of LdcA the resulting tetrapeptide-containing precursors are ineffectively used in subsequent PG synthesis steps and impair the global efficacy of the pathway./p> 40-fold reduction of the MIC of the detergent (Fig. 6b). Growth in the presence of ceftriaxone also increased susceptibility to vancomycin, moenomycin, bacitracin, and erythromycin, which are known to poorly penetrate the outer membrane of Gram-negative bacteria (Fig. 6c). Together, these data indicate that bypass of PBPs by YcbB was associated with the permeabilization of the outer membrane in the presence of ceftriaxone. This implies that the mode of action of β-lactams may involve a positive loop in which binding of the drugs to their targets promotes drug access to the periplasm. Damage to the outer membrane mediated by reactive oxygen species (ROS) may be involved in this process since increased lipid peroxidation was detected by a colorimetric assay (Supplementary Fig. S7h)./p> transposome® (Lucigen). For each electroporation, transformed cells were incubated at 37 °C for 1 h in 2 ml of BHI broth supplemented with 10 µg/ml tetracycline and 20 µg/ml chloramphenicol. Cells were plated on 20 BHI agar plates (100 µl per plate) supplemented with 50 µg/ml kanamycin, 40 µM IPTG, and 1% l-arabinose in the absence (condition −CRO) or presence (condition +CRO) of 8 µg/ml ceftriaxone. Plates were incubated at 37 °C for 16 h (condition −CRO) or 24 h (condition +CRO). Cells were recovered from sets of 20 plates (corresponding to the same electroporation) in two steps by scrapping with 4 ml of BHI broth containing 20% glycerol followed by an additional wash of the plates with 4 ml of the same medium. The bacterial suspensions obtained for each electroporation were kept at −80 °C. For the −CRO condition, a total of 810,000 CFUs was obtained in 7 electroporations. For the +CRO condition, a total of 260,000 CFUs was obtained in 10 electroporations./p> 0.05 or a fold-change < 4 were eliminated. The resulting set of 179 genes is listed in Supplementary Data File 1b. For pathways or gene clusters containing selectively essential genes in the +CRO condition, we also considered non-essential genes displaying a significantly reduced number of insertions in the +CRO condition (p < 0.05). These genes were deemed to incur a fitness cost./p>