banner
Центр новостей
Отличные заводские цены и отличное качество.

Геометрия закрепления является важным фактором, определяющим направление движения кинезина.

Mar 16, 2024

Научные отчеты, том 12, Номер статьи: 15417 (2022) Цитировать эту статью

1301 Доступов

4 Альтметрика

Подробности о метриках

Моторы на основе микротрубочек кинезина-14 имеют N-концевой хвост, прикрепляющий каталитическое ядро ​​к его нагрузке, и обычно движутся к минус-концам микротрубочек, в то время как большинство других кинезинов имеют C-концевой хвост и движутся к плюсовым концам. Потеря консервативных последовательностей, внешних по отношению к моторному домену, заставляет кинезин-14 переключаться на подвижность плюс-конца, показывая, что N-концевое прикрепление совместимо с подвижностью плюс-конца. Однако систематических исследований роли позиции прикрепления в подвижности минус-конца не проводилось. Поэтому мы исследовали подвижность мономерных кинезинов-14, различающихся только точкой прикрепления. Мы обнаружили, что C-концевая точка прикрепления приводит к тому, что кинезин-14 становится направленным на плюс-конец, при этом направление и шаг вращения микротрубочек в анализах подвижности аналогичны таковым для кинезина-1, что позволяет предположить, что как C-кинезин-14, так и N-кинезин-14 -кинезин Кинезин-1 обладает высококонсервативной основной каталитической функцией с присущей ей тенденцией к положительному концу. Таким образом, прикрепление к N-концу является одним из требований для подвижности минус-конца кинезина-14.

Однонаправленное движение моторных белков кинезина вдоль микротрубочек важно во многих клеточных процессах у эукариот, включая транспорт органелл и деление клеток. В целом, большинство N-кинезинов, таких как кинезины от-1 до -10 и -12, у которых моторный домен расположен в N-концевой части, движутся к плюс-концам микротрубочек, в то время как некоторые C-кинезины, такие как кинезин-14, в которых моторные домены расположены в С-концевой части, движутся к минус концам микротрубочек1,2. Однако не все кинезины обладают такой чисто однонаправленной подвижностью, и недавно переключение направления наблюдалось у некоторых кинезинов дрожжей и грибов. Некоторые кинезины-5, N-кинезины, которые обычно направлены к плюсовому концу, обладают замечательной способностью также перемещаться к минусовому концу микротрубочек и переключать направленность при различных условиях3,4,5,6,7, тогда как некоторые кинезины-5, 14 (C-кинезин, которые обычно направлены на минус-конец) демонстрируют контекстно-зависимую двунаправленность8,9. Несмотря на противоположные конечные направления их продольной подвижности, каталитическое ядро ​​N-кинезинов, таких как кинезин-1, и C-кинезинов, таких как кинезин-14, удивительно схоже по своей трехмерной структуре и аминокислотным последовательностям1,10,11. Кроме того, N-кинезины, такие как кинезины-112, -213, -314, -515, -616 и -817 и C-кинезин кинезин-1418,19 также генерируют крутящий момент, который вместе с их продольной подвижностью приводит к похожее на штопор перемещение микротрубочек, скользящих по множеству моторов, прикрепленных к поверхности. За исключением процессивного димерного кинезина-1, который точно отслеживает отдельный протофиламент в микротрубочке20, N-кинезины, направленные на плюс-конец, вызывают левостороннее штопорное движение микротрубочки12, тогда как кинезин-14, направленный на минус-конец, Ncd совершает правостороннее штопорное движение18. Такое изменение направления «штопора» в зависимости от направления предполагает, что компонент подвижности кинезина, генерирующий боковой крутящий момент, совершенно одинаков в обоих типах моторики (дополнительный рисунок 1)12.

В отличие от сходства структуры и функций каталитического ядра, кинезин-1 и кинезин-14 имеют свои собственные уникальные области, прилегающие к C- и N-концу их каталитического ядра (рис. 1a и дополнительные рис. 2a,b). ). В кинезине-1 С-концевая область из ~15 аминокислот, называемая шейным линкером, которая простирается от α6-спирали в каталитическом ядре, претерпевает конформационные изменения, вызванные изменениями в состоянии нуклеотидов кинезина21,22. Считается, что стыковочная конформация этого шейного линкера с каталитическим ядром является основным событием, генерирующим силу для N-кинезинов. Недавно предполагалось, что N-концевая β-цепь, называемая покровной нитью, выступающая из моторного ядра кинезина-1, взаимодействует с шейным линкером, образуя «пучок покров-шея», который модулирует генерацию силы вдоль как микротрубочек, так и шейных линкеров. продольная23,24 и короткие боковые оси25. Однако механизм генерации силы стыковки шейного линкера не сохраняется во всех N-кинезинах, поскольку у некоторых N-кинезинов, таких как кинезины-6 и -10, отсутствуют типичные области шейных линкеров26,27. В отличие от N-кинезинов, C-кинезиновые кинезины-14 обладают уникальной α-спиральной структурой, называемой шейной спиралью, соединенной непосредственно с N-концом β1-листа каталитического ядра, которая высоко консервативна во всех кинезинах. -14 участников28. Было высказано предположение, что вращательное колебание шейной спирали отвечает за создание силы и направленность минус-конца в кинезинах-14, что эквивалентно повороту плеча рычага, предложенному для актиновых моторных белков миозина29, хотя нуклеотидное состояние, в котором Качания шеи и спирали остаются спорными19,30,31,32. Кроме того, кинезин-14 также содержит С-концевой короткий участок, называемый шейным мимиком, который выступает из α6-спирали. Хотя шейный имитатор мало похож на шейный линкер N-кинезинов на уровне аминокислот, он содержит несколько основных и гидрофобных аминокислот, которые высоко консервативны в кинезине-14s33. Мимик шеи не был обнаружен в кристаллографических или криоэлектронных микроскопических структурах кинезина-14s дикого типа Drosophila melanogaster Ncd30,34 или Saccharomyces cerevisiae Kar335, но был обнаружен в структуре члена кинезина-14 KCBP (кинезин-подобный кальмодулин-связывающий белок), где С-концевая область, включающая мимик шеи, пристыкована к каталитическому ядру таким же образом, как и шейный линкер в N-кинезинах36. У Ncd с единственной мутацией T436S также было показано, что первые три остатка шеи-мимической области стыкуются с каталитическим ядром31. Биохимические анализы и анализы подвижности также указывают на то, что шейный имитатор Ncd может регулировать сродство связывания Ncd с микротрубочками и подвижность, направленную на минус-концы33. Эти исследования показывают, что С-концевая шейно-мимическая область в С-кинезинах может также участвовать в генерации силы для подвижности, направленной на минус-конец, аналогично шейному линкеру N-кинезинов для подвижности, направленной на плюс-конец. .

 1 µm in length and did not cross each other were analyzed. A fixed bright spot on the cover glass was tracked to distinguish the displacement of microtubules by drift from the microtubule gliding driven by slow motor activity. Directionality and velocities were determined using measurements from at least three independent assays for each construct./p> 0.25 μm) along a microtubule. Those on fluctuating, bundled, or crossed microtubules were ignored. QDs that encountered other QDs were also excluded. Individual transporting velocity of each QD covered with multiple monomeric kinesins was calculated by dividing the distance travelled by the time interval (0.3–2 s) using the automated tracking software Mark255. When the QD stopped moving, the analysis was ceased at that point. Fluorescence images of QDs were fitted with a 2D Gaussian to locate the position of the intensity peak of fluorescence, corresponding to the center of the QD. Directionality and velocities were determined using measurements from at least three independent assays for each construct./p>